原文發表於第 11 屆 iT 邦幫忙鐵人賽 (https://ithelp.ithome.com.tw/articles/10219591)
進入轉錄體流程篇
已經寫完了奠定基礎功的七篇，第八天開始就會是基礎分析流程之工具使用。想當初我剛開始進行碩論中 RNA-seq 這個試驗方法的時候，正巧看到一篇寫得很好讀的 Review 文章，因此初期透過該文及相關課程 (註) 建立了基礎的觀念，後來才陸續閱讀更源頭的文獻補齊各種缺漏。本系列文之轉錄體流程篇現階段預計不涉及觀念解釋，僅呈現工具之使用，一來因本人能力有限，二來則是因為現在大部分生技公司都有一套自動化流程，只要顧客填表單就會協助產生一套報表。報表包含顧客可以直接用在文章中的圖表，因此有時候讀到中國出的文章，就會看到很眼熟的視覺化風格。也就是說，轉錄體流程部分，有興趣的人自然會想辦法研究到懂，而推測本指南的目標讀者也不需要實際執行這階段的分析，因此現階段初稿會較為精簡，僅達題綱之用。
註：記憶所及，在台大上的相關課程包括生物資訊導論、基因體與系統生物學。
fastq 格式簡介
Fastq 檔案中，每四行就是一段序列之描述。第一行與第三行分別固定以 @ 和 + 符號開頭，其後為針對該序列之描述，內容完全相同或第三行 + 號後省略。第二行為核苷酸代號，第四行則是描述該核苷酸鹼基定序品質。關於品質為什麼用單一字符來代表，以及其確切對應品質之計算方式請見國際連結中提供的圖片及說明。
DNA 定序過程中，藉由在合成的過程中發出螢光，電腦判讀螢光訊號，再轉換成數位格式儲存。
依據訊號的解析情形給予該鹼基一個 score，再將此 score 依據下方的對照表轉換成單一字符。
現在規格已經逐步同步，都是使用 Phred+33 的表示方式。
FastQC 使用
Babraham Bioinformatics - Public Projects Download
下載相對應作業系統之安裝檔案，java 開發，跨平台可用，以下以 mac 為例。
下載後開啟 fastqc_v0.11.8.dmg 檔案，可以選擇直接執行或是將 [FastQC.app](http://fastqc.app) 拖曳複製到 Applications。
執行方式必須要按右鍵以 open，否則無法執行。
(上圖便是直接雙擊執行 app 之後的視窗，之後遇到的許多生物資訊軟體在 mac 上因為不是認證的開發者，所以都要用右鍵開啟才能執行)
(上圖是以用右鍵開啟執行，出現 Open 了)
起始畫面就是這麼樸實無華且枯燥
不能直接拖曳檔案進去，請去左上角之 File 開啟要檢查的 fastq 檔案
試著找到需要檢查的檔案位置
這筆檔案是以下方指令下載，僅有五千條讀序 (spot)
fastq-dump -X 5000 --split-files SRR3406492
報告畫面，左側可以看到共有十個頁籤
每個頁籤的內容，基本上就是字面上的意思，他們的官方網頁上有更詳盡的說明。值得一提的是出現黃色驚嘆號或紅色的叉叉，並不代表真的有問題，有些其實是自然現象，因此通常看第二個頁籤的 Per base sequence quality 的盒方圖就可以大致判定這筆序列有沒有問題囉！
如果有任何安裝與使用上的問題，需要中文支援，歡迎在下方留言～